Principiul. Numărarea leucocitelor în timpul microscopiei într-un anumit număr de pătrate ale camerei de numărare și calcularea numărului lor în 1 litru de sânge, luând în considerare diluția sângelui și volumul camerei de numărare.
Reactiv: soluție 3-5% de acid acetic, colorată pentru colorarea nucleelor de leucocite cu câteva picături de soluție de albastru de metilen. Soluția are o culoare albastră, poate fi stocată mult timp.
Cursul de determinare. Într-un tub de testare uscat se toarnă 0,4 ml soluție de acid acetic. Se colectează 0,02 ml de sânge dintr-un deget (puteți utiliza sânge venos stabilizat cu anticoagulant). Ștergeți vârful pipetei, apoi suflați sângele de pe ea până la fundul tubului, amestecați, re-formați și suflați amestecul de sânge și reactiv (pipetare). Etichetați tubul și lăsați-l până la numărare. A se păstra un amestec de sânge cu o soluție de acid acetic nu este recomandat mai mult de 2-4 ore.
Sângele diluat într-un tub de testare cu acid acetic, se amestecă bine și se umple cu o cameră de numărare. Camera umplută este lăsată într-o poziție orizontală timp de 1 minut pentru a depune celulele albe din sânge. Fără a schimba poziția orizontală a camerei, acesta este plasat pe scena microscop și la o mărire redusă (ocular 10 ×, lentilă 8 x) contorizează leucocite în pătrate mari 100, ceea ce corespunde la 1600 mici.
Pentru o mai mare acuratețe, leucocitele sunt numărate pe grilă în pătrate mari, care nu se împart în mici pătrate și dungi, plecând de la colțul din stânga sus al grilajului. Pentru un contrast mai bun, întunecați câmpul de vizualizare, lăsând condensatorul și închizând diafragma. Celulele situate în interiorul pătratului și situate pe oricare două linii sunt numărate pentru a nu număra aceeași celulă de două ori.
Calculul numărului de leucocite se efectuează conform formulei:
unde X este numărul de leucocite în 1 μl de sânge; și - numărul de leucocite în 100 de pătrate mari; 20 - diluție de sânge; 100 este numărul de pătrate mari; 250 este factorul de conversie pentru 1 μl, deoarece volumul unui pătrat mare este de 1/250 μl (latura pătratului este de 1/5 mm, înălțimea este de 1/10 mm).
În practică, pentru a calcula numărul de leucocite în 1 ml de sânge în numărul de pătrate mari 100 este multiplicat cu 50, iar în 1 l - valoarea rezultată înmulțită cu 106.
Notă. La numărarea leucocitelor, o eroare este inevitabilă în 6-8% din cazuri.
- Cu un număr mare de normococi în sângele periferic, ele sunt numărate în numărul de leucocite (atât leucocite și normococite - celule nucleate). Pentru a stabili în mod corespunzător numărul de leucocite, din numărul total de celule sanguine nucleate ar trebui să scadă numărul de normocite.
- Erorile rămase sunt similare cu cele care apar atunci când se calculează numărul de celule roșii din camera de numărare.
Calculul leucocitelor
Pentru a colecta sângele în mixerul leucocitelor până la nota 0.5. Se adaugă imediat în sânge o soluție de diluare a acidului acetic 3% pentru a marca 11. Se amestecă bine conținutul capilarului și se reumple camera lui Goryaev cu ea. Numărarea se efectuează în cel puțin 100 de pătrate mari. Acestea sunt linii mari neincrezate, grupate în patru în grila camerei Goryaev. Se calculează numărul de leucocite în 1 l de sânge prin formula:
L = N x 4000 x 20 x 10 6
unde: N este numărul de leucocite dintr-o sută de pătrate mari; 4000 este un multiplicator care reduce volumul unui pătrat mic la volumul de 1 μl de sânge; - corecția pentru gradul de diluare a sângelui; 1600 - numărul de leucocite în pătrate mici; 10 6 - numărul microliturilor în 1 l.
Recomandări pentru înregistrare
În concluzie, comparați rezultatele obținute cu valorile normale.
Laboratorul № 7.3
Determinarea cantității de hemoglobină din sânge
194.48.155.245 © studopedia.ru nu este autorul materialelor care sunt postate. Dar oferă posibilitatea utilizării gratuite. Există o încălcare a drepturilor de autor? Scrie-ne | Contactați-ne.
Dezactivați adBlock-ul!
și actualizați pagina (F5)
foarte necesar
Numărătoarea numărului de celule albe din sânge
Leucocitoza poate fi absolută (adevărată) și relativă (redistributivă).
Leucocitoza absolută se observă în procesele inflamatorii acute, necroză tisulară, infecții bacteriene acute (cu excepția febrei tifoide, bruceloză, tularemie etc.), afecțiuni alergice, tumori maligne (cu distrugerea țesuturilor), leziuni la nivelul capului închise și hemoragii în creier, diabet. coma uremică, șoc, pierdere acută de sânge, ca reacție primară - cu boală prin radiații. O creștere semnificativă a numărului de leucocite apare la leucemie.
Relativ (redistributiv) este o consecință a primirii de leucocite în fluxul sanguin din organele care servesc pentru depozitul ei. Apare după mâncare (leucocitoză alimentară), băi calde și reci, emoții puternice (leucocitoză vegetovasculară), muncă musculară intensă (leucocitoză miogenică) etc.
Leucopenie. Leucopenia este privit ca un indicator al funcției măduvei osoase capacitate opresiune din cauza expunerii la substanțe toxice (arsenic, benzen și alții asemenea), unele medicamente (sulfonamide, cloramfenicol, fenilbutazona, immuran, ciclofosfamidă, etc.), virusuri (gripa, hepatita virală, rujeolei etc.), microbi (tifoid, bruceloză etc.), radiații ionizante, raze X și hipersplenism (funcția spline crescută).
Leucocitoza și leucopenia sunt rareori caracterizate de o creștere proporțională (scăderea) a numărului total de leucocite de toate tipurile (de exemplu, leucocitoză cu îngroșarea sângelui); În cele mai multe cazuri, există o creștere (scădere) a oricărui tip de o celulă, cu toate acestea, termenii „neutrofilie“ „Neutropenie“ „limfocitoza“, „limfopenie“, „eozinofilie“, „eosinopenia“, „monocitoza“, „monotsitopeniya“, "Basophilia".
În evaluarea clinică a modificărilor numărului de leucocite, o mare importanță se acordă raportului procentual al formelor individuale de leucocite, adică formula leucocitelor.
Numărul de sânge al leucocitelor unei persoane sănătoase:
Valoarea relativă Suma absolută
Basophils............................ 0-1% 0-0.0650 x 10 9 / l
Eozinofile.........................0,5-5% 0,02-0,30 x 10 9 / l
Neutrofile: - mielocite............ 0% absente
- înțepat... 1-6% 0,040-0,300 x 10 9 / l
- segmentat....47-72% 2.0-5.5 x 10 9 / l
Limfocite..................................19-37% 1.2-3.0 x 10 9 / L
Monocite...............................3-11% 0,09-0,6 x 10 9 / L
Calculul leucocitelor se efectuează în frotiuri de sânge periferic colorate. Pentru interpretarea corectă a rezultatelor studiului formulării leucocitelor, se recomandă să conteze în cantități absolute, dar nu și în cele relative. Cele mai comune metode de pictură de pete de Romanovsky-Giemsa, Pappenheim. Sub imersiune, se măsoară cel puțin 200 de celule și apoi se determină raportul procentual al anumitor tipuri de leucocite. Analiza leucogramei ținând cont de alți parametri sanguini și imaginea clinică este o metodă valoroasă de examinare, ajută la diagnosticarea și determinarea prognosticului bolii.
Principalele cauze ale neutrofilei.
Infecții bacteriene acute - localizate și generalizate.
Inflamația sau necroza țesutului.
Efecte medicamentoase (corticosteroizi).
Principalele cauze ale neutropeniei.
Infecții - bacteriene (febră tifoidă, bruceloză, tularemie, febră paratihoidă) și virale (hepatită infecțioasă, pojar, gripa, rubeolă și altele).
Efectele mielotoxice și suprimarea granulocitopoiezei (radiații ionizante, agenți chimici - benzen, anilină, DDT, efecte medicinale - citostatice și imunosupresoare, vitamina B12-anemie cu deficit de acid folic, leucemie aureusică acută, anemie aplastică).
Efectele anticorpilor (forme imune) - giperchuvtvitelnost la medicamente, boli autoimune (LES, artrita reumatoida, leucemie limfocitară cronică), manifestări isoimmune (boala hemolitică a nou-născutului).
Redistribuirea și depunerea în organe - condiții de șoc, boli cu splenomegalie și hipersplenism.
Forme ereditare (neutropenie cronică familială benignă).
Principalele cauze ale eozinofiliei.
Invazii parazitare (trichinoză).
Leziuni cronice ale pielii - psoriazis, pemfigus, eczeme.
Tumori (variante eozinofile de leucemie).
Alte boli - endocardita fibroplastică Lefflera, scarlatină.
În faza de recuperare a infecțiilor și a bolilor inflamatorii (semn prognostic favorabil).
Cauze ale eozinopeniei (aneosinofilie).
Creșterea activității adrenocorticoizilor în organism.
Principalele cauze ale bazofiliei:
Leucemia cronică mieloidă și eritremia.
Principalele cauze ale monocitozelor.
Infecții bacteriene subacute și cronice.
Infecții parazitare - leishmaniasis, malarie.
Hemoblastoză - leucemie monocitară, limfogranulomatoză, limfoame.
Alte afecțiuni sunt SLE, sarcoidoza, artrita reumatoidă, monocitoza infecțioasă; în perioada de recuperare de la infecții, la părăsirea agranulocitoză, după splenectomie.
Scăderea numărului de monocite este importantă în principal în evaluarea raportului limfocite-monocitic în tuberculoza pulmonară.
Principalele cauze ale limfocitelor.
Infecții - virusul acut (mononucleoza infecțioasă, rujeola, rubeola, varicela), bacteriile cronice (tuberculoză, sifilis, bruceloză), protozoare (toxoplasmoză).
Hemoblastoză (leucemie limfocitară, limfom).
Alte boli - hipertiroidism, boala Addison, vitamina B12-anemie cu deficit de foliu, anemie hipo-și aplastică.
Limfocitopenia este observată în SLE, boala Hodgkin, tuberculoza larg răspândită a ganglionilor limfatici, în stadiul terminal al insuficienței renale, boala de radiație acută, starea imunodeficienței, administrarea de glucocorticoizi.
Creșterea sau scăderea numărului anumitor tipuri de leucocite din sânge poate fi relativă sau absolută. Dacă se modifică doar procentul unui anumit tip de celule albe din sânge, atunci au loc neutrofilia relativă, eozinopenia relativă etc. Creșterea sau scăderea conținutului absolut al oricărui tip de leucocite, adică numărul acestor celule pe unitatea de volum de sânge, se numește neutrofilie absolută, eozinopenie absolută etc.
Schimbarea formulei la stânga (creșterea numărului de forme tinere de neutrofile) este un semn al inflamației sau al unui proces necrotic în organism.
Deplasarea formulei leucocitelor spre dreapta este caracteristică bolii radiațiilor și a vitaminei-B12-anemia deficitului de acid folic.
Absența sau reducerea semnificativă a numărului tuturor tipurilor de leucocite granulare - granulocite (neutrofile, eozinofile, bazofile) este desemnată prin termenul agranulocitoză. În funcție de mecanismul de apariție, se disting mielotoxice (efectele radiației ionizante, aportul citostatic) și imun (hapten și agranulocitoză autoimună).
Calculul leucocitelor
Metoda de numărare în cameră. Luarea și diluarea sângelui produs prin metoda tubului. 0,4 ml din fluidul diluant și 0,02 ml de sânge capilar sunt introduse în tub (de preferință Vidalevskaya). Diluția rezultată este considerată în mod substanțial egal cu 1: 20. Ca lichid de diluare este în mod tipic consumă soluție de acid acetic 3-5% colora cu albastru de metilen (lizeaza de acid acetic eritrocite, leucocite nuclei albastru de metilen a petelor). Înainte de umplerea camerei tubul Goryaeva cu sânge diluat este bine agitat. Camera este umplută în același mod ca și pentru numărarea eritrocitelor.
Leucocitele sunt mult mai mici decât eritrocitele (1-2 pe pătrat mare), prin urmare, pentru corectitudine, numărătoarea este făcută în 100 de pătrate mari (neabsorbite). Calcul: 100 de pătrate mari (1600 mici) sunt numărate drept leucocite.
Amintim că volumul unui pătrat mic este de 1/4000 mm3, iar sângele este diluat de 20 de ori, numărul de leucocite în 1 μl de sânge este calculat: 4000 20 și împărțit la 1600 = a x 1/2. Practic, pentru a obține conținutul efectiv de leucocite în 1 μl de sânge, este suficient să se împartă la jumătate numărul obținut în calcul și să se adauge 2 zerouri. Eroarea medie a metodei este ± 7%.
Mai precis (2-3% eroare) și perfect este numărul de leucocite folosind dispozitive electronice. Numărătoarea leucocitelor în contoarele de particule se efectuează conform aceluiași principiu ca și eritrocitele. Pre-sânge este diluat și amestecat cu orice reactiv lizând celulele roșii din sânge. În analizorul auto "Technicon" se utilizează ca atare o soluție de acid acetic în dispozitivele "Culter" și "Celloskop" - saponină sau sapoglobină, care se adaugă diluat (1: 500, 1: 700) în soluție izotonică de clorură de sodiu diluare).
Stabilirea numărului de leucocite din sânge este efectuată în frotiuri de sânge periferic colorate.
Este mai bine să numărați la cel mai subțire punct de la sfârșitul frotiului, cel puțin 200 de celule (cu excepția leucopeniei pronunțate) și apoi să deduceți raportul procentual al anumitor tipuri de celule albe din sânge. Numărarea este recomandată în aceeași ordine: jumătate din celule trebuie să fie numărate în partea de sus, jumătate în partea de jos a cursei, fără a se deplasa la marginea și la mijloc, zig-zag (3-4 câmpuri de vedere de-a lungul cursei, 3-4 câmpuri în unghi drept la mijlocul cursei, apoi 3-4 câmpuri laterale în paralel cu marginea, din nou în unghi drept în sus și așa mai departe pe o parte).
Pregătirea frotiurilor. Sticla spălată și degresată cu atenție (marginea sa) atinge o picătură de sânge la locul injectării. Smear face sticlă de șlefuire, punându-l la un unghi de 45 ° la diapozitiv în fața picătură. După ce a adus paharul la această picătură, ei așteaptă până când sângele se întinde de-a lungul marginii sale, apoi cu o mișcare ușoară ușoară efectuează înainte sticla de măcinat și nu o îndepărtează de subiectul înainte de a se usca întreaga picătură.
Un frotiu realizat corect are o culoare gălbuie (subțire), nu atinge marginile paharului și se termină cu o urmă (mustață).
Colorarea frotiurilor uscate produse după fixarea preliminară. Cea mai bună fixare este obținută în alcool metilenic absolut (3-5 minute) sau într-un amestec de Nikiforov care are părți egale de etanol absolut și eter (30 minute).
Principalele vopsele hematologice includ albastrul de metilen și derivatul său - azura I (azotă de metilen) și azura II (un amestec de părți egale de azur I și albastru de metilen), la eozina galbenă solubilă în apă.
● Pictura lui Romanovsky-Giemsa. Vopseaua Romanovsky-Giemsa (fabricată din fabrică) are următoarea compoziție: Azur II - 3 g, eozină galbenă solubilă în apă - 0,8 g, alcool metilic 250 ml și glicerină 250 ml. Soluția de vopsea de lucru este preparată la o viteză de 1,5-2 picături de vopsea finită per 1 ml de apă distilată. Vopseaua este turnată într-o frotiu cu un strat posibil mai mare; timpul de colorare - 30-35 de minute După această perioadă, tampoanele se spală cu apă și se usucă în aer. În această metodă, este posibilă diferențierea nucleului bine, dar granularitatea neutrofilă a citoplasmei este mult mai gravă, deci este larg utilizată pentru colorarea frotiului de sânge periferic.
● Colorație combinată May-Grunwald-Romanovsky-Giemsa conform Pappenheim. Un colorant finit, un fixativ May-Grunwald, care este o soluție de albastru eozinmetilen în alcool metilenic, este pipetat pe un frotiu fix timp de 3 minute. După 3 minute, se adaugă o cantitate egală de apă distilată la vopseaua care acoperă soluția și colorarea este continuată timp de încă un minut. După aceea, vopseaua este spălată și frotiul este uscat în aer. Apoi, frotiu uscat este repetat cu o soluție apoasă proaspăt preparată de vopsea Romanovsky timp de 8-15 minute. Această metodă este considerată cea mai bună, în special pentru frotiurile de măcinare a măduvei.
O creștere a numărului de leucocite din sângele periferic deasupra nivelului normal se numește leucocitoză, o scădere se numește leucopenie. Leucocitoza (leucopenie) este rar caracterizată de o creștere proporțională (scăderea) a numărului de leucocite de toate tipurile, de exemplu, leucocitoză cu îngroșarea sângelui. În cele mai multe cazuri, există o creștere a numărului (scăderii) oricărui tip de celulă. Creșterea sau scăderea numărului de tipuri individuale de leucocite din sânge poate fi relativă sau absolută, în funcție de numărul total de leucocite - normal, ridicat sau scăzut. Schimbarea numărului, a raportului dintre formele individuale și morfologia leucocitelor depinde de tipul și virulența agentului patogen, natura, cursul și amploarea procesului patologic, reacția individuală a organismului.
Leucocitele (leucocitele)
Leucocitele. Determinarea cantitativă a leucocitelor. Numărarea leucocitelor folosind camera Goryaeva. Conținutul cantitativ al leucocitelor. Leucocitoză.
Celulele sanguine albe
Numărul de leucocite din sânge depinde atât de viteza de formare, cât și de mobilizarea lor din măduva osoasă, precum și de utilizarea și migrarea lor în țesuturi (la leziuni), captarea de către plămâni și splină. Aceste procese, la rândul lor, sunt influențate de o serie de factori fiziologici și, prin urmare, numărul de leucocite din sângele unei persoane sănătoase este supus fluctuațiilor: crește până la sfârșitul zilei, în timpul efortului fizic, stresului emoțional, consumului de alimente din proteine și modificărilor abrupte ale temperaturii ambientale.
Determinarea cantitativă a leucocitelor
Leucocitele sunt contorizate utilizând camera Goryaev și utilizând contoare automate.
Numărarea leucocitelor folosind camera Goryaeva
Cu metoda in vitro de a lua sânge pentru a număra leucocite:
- 0,4 ml dintr-o soluție de acid acetic 3-5% colorată cu albastru de metilen este turnată în tub. Utilizați o pipetă capilară pentru a extrage 20 μl de sânge dintr-o picătură proaspătă (diluție de 20 de ori), lăsați-o cu grijă într-o eprubetă cu reactiv și clătiți pipeta. Se amestecă bine;
- o sticlă de acoperire curată și uscată se freacă pe cameră astfel încât să se formeze inele de curcubeu în punctul de contact;
- sânge diluat într-un tub de testare, se amestecă bine. Sfârșitul unei tobe de sticlă rotundă ia o picătură de sânge și o aduce la marginea geamului lustruit al camerei;
- după umplerea camerei, se lasă timp de 1 minut în repaus pentru sedimentarea leucocitelor;
- Leucocitele sunt considerate la mărire mică (obiectivul × 8 sau × 9, ocularul × 10 sau × 15) cu un câmp de vedere întunecat (cu un condensator coborât sau diafragmă îngustată);
- pentru rezultate satisfăcătoare, leucocitele sunt numărate în 100 de pătrate mari.
Cunoscând volumul unui pătrat mare și gradul de diluare a sângelui, găsiți numărul de leucocite în 1 μl și 1 l de sânge. Latura pătratului mare este de 1/5 mm, suprafața este de 1/25 mm2, volumul spațiului de deasupra acestui pătrat este de 1/250 mm3.
Formula pentru numărarea celulelor albe din sânge:
unde B este numărul de leucocite în 100 de pătrate mari;
P - gradul de diluție (20).
Calculul leucocitelor
Normă: 4.0-9.0 × 10 9 / L
Se numește creșterea numărului de leucocite de peste 9,0 × 10 9 / l
leucocitoză, o scădere a numărului acestora sub 4,0 × 10 9 / l - leucopenie. Totuși, chiar și 3,5 × 10 9 în 1 l de leucocite pentru un număr de indivizi poate fi normală. Conform literaturii, astfel de oameni au crescut rezistența la imunitate și sunt mai puțin susceptibili să se îmbolnăvească, ceea ce pare să se datoreze necesității unui răspuns imun pentru a avea o rezervă de leucocite în țesuturi, unde există 50-60 de ori mai mult decât în sânge. Evident, la persoanele sănătoase cu număr scăzut de celule albe din sângele periferic, rezervele lor în țesuturi sunt în mod corespunzător crescute. Acest fenomen se explică prin caracter ereditar și familial sau printr-o creștere a influenței sistemului nervos parasympatic.
Leucopenia poate fi funcțională și organică.
Leucopenia funcțională este asociată cu disreglementarea formării sângelui și se observă:
- cu unele infecții bacteriene și virale (febră tifoidă, gripă, variolă, rubeolă, boala Botkin, pojar);
- sub acțiunea medicamentelor (sulfonamide, analgezice, anticonvulsive, antitiroidiene, citostatice și alte medicamente);
- în timpul muncii musculare, introducerea de proteine străine, a nervilor și a efectelor de temperatură, de foame, de stări hipotonice;
- leucocitopenia falsă poate fi asociată cu agregarea leucocitelor în timpul depozitării pe termen lung a sângelui la temperatura camerei (mai mult de 4 ore).
Leucopenia organică rezultată din aplazia măduvei osoase și înlocuirea acesteia cu țesut adipos are loc atunci când:
- anemie aplastică;
- agranulocitoză;
- leucemie leucopenică;
- unele forme de boală Hodgkin;
- radiații ionizante;
- hipersplenism (primar și secundar);
- bolile colagenului.
leucocitoză
Leucocitoza este reacția sistemului hematopoietic la efectele acestuia
factori exogeni și endogeni. Există leucocitoză fiziologică și patologică.
Leucocitoza fiziologică este:
- digestiv - după masă, în special bogat în proteine; numărul de leucocite nu depășește 10,0-12,0 × 109 / l și după 3-4 ore revine la normal;
- cu stres emoțional (adrenalină), efort fizic sever, răcire, expunere excesivă la soare (arsuri solare), administrarea unui număr de hormoni (catecolamine, glucocorticosteroizi etc.), în a doua jumătate a sarcinii, în timpul menstruației și datorită distribuției inegale a leucocitelor în sânge mainstream.
Leucocitoza patologică este împărțită în absolută și relativă.
Leucocitoza absolută - o creștere a numărului de leucocite din sânge până la câteva sute de mii (100,0-600,0 × 109 / l și mai mult).
- Cel mai adesea observat la leucemie: în leucemie cronică - în 98-100% din cazuri, în leucemie acută - în 50-60%. Schimbarea raportului dintre celulele leucocite din măduva osoasă și punctatul de sânge servește drept bază pentru diagnosticarea leucemiei.
Leucocitoza relativă este observată:
- procese inflamatorii și infecțioase acute, cu excepția febrei tifoide, a gripei, a variolei, a rubeolei, a bolii Botkin, a rujeolei. Cea mai mare leucocitoză (până la 70,0-80,0 × 109 / l) este observată la sepsis;
- sub influența substanțelor toxice (otrăvuri de insecte, endotoxine), radiații ionizante (imediat după iradiere);
- ca urmare a acțiunii preparatelor corticosteroizi, adrenalină, histamină, acetilcolină și digitalică;
- cu dezintegrarea țesuturilor (necroza), infarctul miocardic, tromboza arterelor periferice cu dezvoltarea de gangrena, arsuri, pleurezie exudativă, pericardită, uremie, comă hepatică;
- pierderi semnificative de sânge la leziuni, sângerări interne, ginecologice și altele.
Creșterea numărului de leucocite la bolile infecțioase în majoritatea cazurilor este însoțită de o deplasare a formulei leucocitelor la stânga
Numărarea numărului de leucocite și a trombocitelor
Factorii care afectează corectitudinea studiului celulelor albe din sânge
- depozitarea lungă a sângelui la temperatura camerei
Normele privind conținutul leucocitelor din sânge
Vârsta Numărul de leucocite
- 1 zi 11,6 - 22,0
- 1 săptămână 8.1. - 14.3
- 1 lună 7,6 - 12,4
- Adulți 4.0 - 9.0
Metode pentru determinarea numărului de leucocite din sânge.
- Numărarea numărului de leucocite în camera de numărare
- Numărarea leucocitelor în analizoarele de hematologie
Determinarea numărului de leucocite în camera de numărare.
- Numărarea leucocitelor la microscop se efectuează după liza celulelor roșii din sânge în pătrate mari 100 din grila de numărare și convertit la 1 litru de sânge, pe baza volumului de pătrate și o diluție de sânge. Numărătoarea leucocitelor trebuie efectuată în 2-4 ore după colectarea sângelui.
- Dacă există celule roșii nucleate în sângele periferic, acestea nu sunt lizate și numărate împreună cu leucocitele. În acest caz, pentru a determina numărul real de leucocite, numărul de celule din rândul roșu este scăzut din numărul total de celule numărate.
- De exemplu: Numărul total de leucocite la calcul în cameră (sau analizor) -45x109 / l. La calcularea formulei de leucocite, s-a constatat că 50 de eritroblaști (normoblaști) sunt prezenți la 100 de leucocite.
Calculăm numărul real de leucocite din sânge:
150 de celule - 45 x 109 / l
100 de celule (leucocite) - X
X = 100 * 45 * 10 / l / 150 = 30 * 10 / l
Astfel, numărul real de leucocite din sânge este de 30 x 109 / l.
Principalele surse de eroare în calculul leucocitelor din cameră:
- Raport incorect al sângelui și al volumelor de acid acetic luate într-un tub de testare.
- Soluție incorect preparată de acid acetic (la o concentrație mai mare de 5%, unele leucocite pot fi lizate, ceea ce va duce la o subestimare a rezultatului).
- Expunerea prelungită a probei la temperaturi de peste 28 ° C, care pot accelera liza leucocitelor din probă și pot duce la o subestimare a rezultatelor.
- Umplerea incorectă a camerei Goryaev. La fel ca în cazul calculului celulelor roșii din sânge, camera trebuie lăsată timp de 1 minut pentru a depune celulele.
- Camera Goryaev nu a fost spălată suficient după definiția precedentă. Leucocitele rămase în cameră pot supraestima rezultatele analizei.
Metodele de numărare a trombocitelor
- în camera de numărare
Fiecare grup de metode are avantaje și dezavantaje.
- Numărarea trombocitelor în cameră este suficient de precisă, nu necesită calcularea numărului de celule roșii din sânge. Pe de altă parte, această metodă este mai laborioasă, deoarece trombocitele în forma nativă sunt reprezentate de elemente mici și puțin contraste. Dezavantajul metodei este numărarea trombocitelor în orele următoare după ce a fost luat sânge.
- Determinarea numărului de trombocite din frotiurile de sânge este semnificativ inferioară în precizia sa față de metoda camerei sau de contoarele automate. Erori la contorizarea frotiurilor de sânge pot fi datorate calității slabe a frotiului și distribuției inegale asociate a trombocitelor, determinării incorecte a numărului de globule roșii din sânge. Un dezavantaj semnificativ al metodei este necesitatea de a contabiliza simultan trombocitele și celulele roșii din sânge. Avantajul este capacitatea de a studia trombocitele în orice moment, indiferent de momentul colectării sângelui.
- Metoda de determinare a trombocitelor utilizând un analizor de hematologie vă permite să determinați cu precizie numărul de trombocite, volumul mediu și distribuția lor în volum.
Calculul leucocitelor
Numărul de leucocite se calculează folosind un contor automat sau într-o cameră Goryaev. Pentru a număra leucocitele din cameră, se prepară un lichid turc - se adaugă o soluție de acid acetic colorată cu o soluție apoasă de albastru de metilen (0,1 ml dintr-o soluție de albastru de metilen 0,1% în 9 ml de acid acetic 10%). Într-un tub de testare se toarnă 0,4 ml de lichid Türk. Achiziționați exact 0,02 ml de sânge, adăugați cu grijă la lichidul de diluare. Diluarea sângelui este 1:20. Se amestecă bine și se lasă timp de 4 minute. Umpleți camera Goryaeva, după ce agitați bine tubul cu sânge diluat. Camera este lăsată timp de 1 minut pe o suprafață plană pentru sedimentarea leucocitelor. Apoi leucocitele sunt numărate la mărirea mică a microscopului (lentila 8, ocularul 10 sau 15) cu un câmp de vedere întunecat (cu condensatorul coborât sau diafragma îngustată). Leucocitele sunt considerate a fi în 100 de pătrate mari nedezvăluite, care corespund la 1600 mici. Rezultatele numărării celulelor în pătrate mari sumarizează și calculează numărul lor în 1 μl de sânge utilizând formula:
unde X este numărul de leucocite în 1 μl de sânge; A - numărul de celule numărate în 100 de pătrate mari; 1600 - numărul de pătrate mici; 20 - diluție de sânge; 4000 este un multiplicator care are ca rezultat un volum de 1 μl de sânge, pe baza volumului unui pătrat mic (1/4000 μl).
Numărătoarea formulării de leucocite Se examinează frotiurile colorate din sângele periferic. O condiție necesară pentru o examinare corectă a caracteristicilor morfologice ale celulelor sangvine este un frotiu de sânge realizat corect și bine colorat. Un preparat de sânge este preparat pe diapozitive uscate, curate și bine degresate, îmbătrânite într-un amestec de Nikiforov (alcool etilic 96 ° și dietil eter 1: 1). Luând un diapozitiv de sticlă pentru margini lungi, atingeți suprafața sa la o picătură de sânge (dar nu pe piele) eliberată din puncție sau aplicați o picătură de sânge cu o micropipetă sau un capilar. Un diapozitiv de sticlă este ținut pe masă sau în mâna stângă pentru margini înguste. Cu mâna dreaptă, aplicați sticla măcinată cu o margine îngustă la sticlă, cu sânge la stânga picăturii, sub un unghi de 45 ° și împingeți-o spre dreapta până când atinge sângele. Ei așteaptă până când sângele se întinde pe întreaga margine a paharului de pământ și apoi, cu o mișcare rapidă și rapidă, îl conduce de la dreapta la stânga până când întreaga picătură este epuizată. O picătură de sânge ar trebui să fie mică și proporționată, astfel încât întregul frotiu să fie așezat pe sticlă, fără să ajungă la 1-1,5 cm înainte de marginea sa. Un frotiu bine făcut este subțire, are o culoare gălbuie și se termină într-o "mătură". Fracțiunile de sânge uscate în aer sunt plasate în vase speciale pentru fixare sau în pahare de sticlă obișnuite, umplute cu lichid de fixare (alcool metilic, timp de fixare 3-5 minute, alcool etilic, 30 minute, amestec Nikiforov, 20-30 minute). Preparatele fixe sunt uscate în aer și apoi colorate cu colorant Romanovsky-Giemsa. Soluția fină de vopsea Romanovsky-Giemsa (azureosin) diluată 1:10 în volumul necesar pentru colorare. Reziduurile fixe sunt turnate cu vopsea diluată, care se toarnă pe frotiu cu un strat posibil mai mare. Culoarea durează în funcție de temperatura aerului din cameră de la 25 la 45 de minute. După finisarea vopselei, spălați vopseaua cu apă distilată și puneți-o în relief vertical într-un suport pentru uscare. Microscopia frotiurilor de sânge se efectuează cu imersie la mărire de 100 × 10. Numărarea leucocitelor se efectuează de-a lungul unei linii de zigzag ("linia Meander"), numărătoare de celule 100-200, luând în considerare numărul de forme individuale de leucocite: neutrofile și eșinofile segmentate, eozinofile, bazofile, monocite, limfocite. Calculați procentul fiecărui tip de celulă.
Numărătoarea numărului absolut de fagocite și limfocite Numărul total de fagocite (neutrofile și monocite) și limfocitele vertebratelor superioare se calculează pe baza datelor privind numărul de leucocite din sângele periferic și formula leucocitelor.
Testarea funcției fagocitare
Determinarea indicelui fagocitar și a numărului fagocitar
Au fost elaborate un număr mare de tehnici pentru a evalua activitatea de absorbție și digestie a leucocitelor. Toate acestea se bazează pe capacitatea fagocitelor de a absorbi particulele străine care alcătuiesc sistemul de testare (un tip specific de microorganisme, zymosan, latex - obiect de absorbție). Revelația se efectuează in vitro sau in vivo. Cursul general de determinare este după cum urmează: Sânge proaspăt heparinizat sau citrat (sau suspensie de fagocite) este amestecat cu un volum egal de suspensie microbiană zilnică suspendată (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E. coli, A. nydrophila) sau un alt obiect de absorbție. Amestecul este amestecat ușor și plasat într-un termostat (37-40 ° С - pentru sângele cald, în funcție de temperatura normală a corpului, 26 ° C - pentru pești care iubesc căldura și mai puțin pentru iubirea la rece). După 15, 30, 45, 60 și 90 de minute, frotiurile sunt preparate pe diapozitive, uscate, fixate cu alcool metilic sau cu un amestec Nikiforov și colorate în conformitate cu Romanovsky-Giemsa. Ei se uită la frotiuri sub imersie și determină activitatea fagocitară - procentul de fagocite care participă la fagocitoză, indicele fagocitar - numărul de microbi testați capturați de un leucocite fagocit, numărul fagocitar - numărul mediu de obiecte fagocitare pe 1 neutrofil activ. Evaluarea indicatorilor la intervale de timp diferite ne permite să estimăm dinamica fagocitozei. În mod normal, după 90 de minute, indicele fagocitar ar trebui să fie mai mic decât după 45 de minute și 60 de minute, datorită digestiei microbilor. În caz de încălcare a digestiei, nu se schimbă.
Evaluarea activității funcționale a fagocitelor prin reacția de reducere a tetrazolului nitro-albastru (testul NBT)
Acest test este un indicator al funcției bactericide a fagocitelor și vă permite să evaluați capacitatea acestora de a ucide dependente de oxigen. Când acest mecanism de ucidere este activat, se activează enzima NADPH oxidaza, ceea ce duce la apariția unor specii reactive de oxigen în fagocit. Eliberarea acestor substanțe în celulă se numește o explozie de oxigen (respirator), care poate fi înregistrată utilizând testul NBT. În formularea acestui test, substanța nitrosinium tetrazolium este adăugată la fagocite, este absorbită de celulă și, în prezența speciilor reactive de oxigen, se transformă într-o substanță colorată în culoarea albastru închis, diformazan. Cele mai multe granule de culoare albastru închis sunt fixate pe suprafață sau în interiorul fagocitului, formându-se forme de oxigen mai active, uciderea mai dependentă de oxigen.
Testul NBT este setat în două variante: spontan și indus. Atunci când se efectuează un test spontan NBT, fagocitele sunt cultivate în prezența NST fără activarea prealabilă a celulelor; atunci când se efectuează testul NBT indus, se adaugă un activator al reacției fagocitare la mediul de cultură. Setarea testului NBT în două variante permite calcularea rezervei funcționale a celulelor, care este diferența dintre numărul (intensitatea) celulelor pozitive diformazan induse și numărul (intensitatea) celulelor spormane diformazan-pozitive. Valorile testului indus de NBT caracterizează activitatea celulelor fagocitare în prezența unui stimul antigenic și sunt considerate ca un criteriu al disponibilității lor pentru fagocitoză completă. Testul NBT spontan permite evaluarea gradului de activare a mecanismelor de distrugere a oxigenului dependent de fagocitele neactivate. Caracterizează gradul de activare a sistemelor microbicide intracelulare.
Pentru a forma un test spontan NBT, se adaugă 0,05 ml dintr-o soluție 0,2% de NBT în tampon fosfat de potasiu (0,1, pH 7,3) și 0,05 ml din același tampon la 0,1 ml de sânge. În paralel, se introduce o probă pentru a se ține cont de testul indus de NBT, în care, în loc de 0,05 ml de soluție tampon, se adaugă același volum de activator fagocitar (de exemplu, pirogen la o concentrație de 50 μg / ml). Amestecul de reacție este termostatat într-o baie de apă la 37 ° C (30-60 min). Dozările de densitate medie sunt preparate, uscate în aer și fixate în alcool etilic sau amestec Nikiforov (20 min), apoi vopsite cu o soluție apoasă de roșu neutru (0,1%, 1 min)
După reacție, frotiurile de sânge sunt microscopate sub imersie (100 × lentile, 10 oculare). Printre cele 100 de celule se numără proporția de neutrofile activate (DAN,%) conținând granule de diformazan. Numărul de depozite în celulele diphormazanului evaluează activitatea lor în unități arbitrare și calculează indicele activării neutrofilelor (IAN, utilizat):
unde este HNEG. - numărul de celule care nu conțin granule diformazan;
H1 - numărul de celule în care suprafața depozitelor de diformazan este mai mică de 1/3 din suprafața nucleului;
H2 - numărul de celule în care depozitele de diformazan iau de la 1/3 la întreaga dimensiune a nucleului;
H3 - numărul de celule în care depozitele de diformazan ocupă o arie mai mare a nucleului.
Determinarea coeficientului de mobilizare (KM) efectuat conform următoarei formule: